自從 Sanger等(1975)引入雙脫氧核苷三磷酸( ddNTP)作爲鏈終止劑,DNA序列測定技術得(de)到迅速發展。 ddNTP在DNA聚合酶作用(yòng)下(xià),通(tōng)過其5’三磷酸基團可(kě)以摻入到正在延伸的(de)DNA鏈中,但由于其脫氧核糖3’位置缺少一個(gè)羟基,因此不能同後續的(de)dNTP形成磷酸二酯鍵,使得(de)DNA鏈的(de)延伸被終止。根據此原理(lǐ),在DNA合成反應混合物(wù)的(de)4種dNTP中加入一定比例的(de)一種 ddNTP,dNTP參與的(de)鏈延伸将與ddNTP參與的(de)鏈終止發生随機競争,最終反應産物(wù)是一系列的(de)寡核苷酸鏈,其長(cháng)度取決于從用(yòng)以起始DNA合成的(de)引物(wù)末端到出現過早鏈終止的(de)位置之間的(de)距離。在4組獨立的(de)酶反應中分(fēn)别采用(yòng)4種不同的(de)dNTP,結果将産生4組寡核苷酸鏈,它們将分(fēn)别終止于模闆鏈的(de)每個(gè)A、C、G或T的(de)位置上,通(tōng)過電泳分(fēn)離和(hé)放射自顯影(yǐng),就可(kě)以進行序列判讀。

PCR測序根據标記的(de)方式不同和(hé)循環的(de)次數不同可(kě)分(fēn)爲直接測序法和(hé)循環測序法。

直接測序法

一、原理(lǐ)

PCR擴增: 獲得(de)雙鏈DNA産物(wù)經變性形成單鏈,測序引物(wù)與其中一條模闆鏈上的(de)互補序列退火。退火的(de)引物(wù)在低進行性反應條件下(xià)(如低溫和(hé)低dNTP濃度),通(tōng)過DNA聚合酶催化(huà)作用(yòng)延伸20~80個(gè)核苷酸;由于此反應體系中摻入放射性标記的(de)dNTP,能使新合成的(de)DNA鏈中含有多(duō)個(gè)放射性标記,便于産生高(gāo)放射顯影(yǐng)度。标記的(de)DNA鏈在高(gāo)進行性反應條件下(xià),通(tōng)過DNA聚合酶催化(huà)進行延伸,通(tōng)過在反應體系中摻入 ddNTP,使鏈延伸反應終止。反應産物(wù)經過電泳分(fēn)離和(hé)放射自顯影(yǐng),就可(kě)以進行序列判讀。

二、材料

(1)DNA模闆：PCR産物(wù)離子交換色譜純化(huà),作爲DNA模闆,濃度爲:0.01~0.1mmol/L。

(2)引物(wù)：20個(gè)核苷酸的(de)DNA引物(wù)可(kě)以不經過純化(huà),直接用(yòng)作測序引物(wù),引物(wù)濃度1mmol/L。

(3)DNA聚合酶：要求該酶在低溫條件下(xià)仍具有活性,以便有效地在新合成的(de)DNA鏈中摻入放射性标記。

(4)測序反應緩沖液：根據測序酶具體而定,如測序酶2.0的(de)反應緩沖液可(kě)用(yòng)40mmol/L  Tris-HCl(pH7. 5), 20mmol/L MgCI, Fl 50mmol/L NaCl。

(5)放射性标記的(de)dNTP：一般爲[aP]dATP、[a3P]dATP或[a3S]dATP。

三、方法

(1)制備鏈延伸終止反應混合物(wù)：分(fēn)别在4個(gè)微量離心管中各加入一種 dNTP/ddNTP的(de)混合物(wù)2.5,其中dNTP和(hé)dNTP濃度分(fēn)别爲80mol/L和(hé)8pmol/L,37℃預熱(rè)5min。

(2)制備退火混合物(wù)在一個(gè)微量離心管中加入PCR擴增DNA1pmol,測序引物(wù)1012p 5×測序反應緩沖液,用(yòng)水(shuǐ)調整至總反應體積10pl

在加熱(rè)儀内94~96℃加熱(rè)8min後,迅速放入冰浴中冷(lěng)卻lmin(适合于雙鏈DNA模闆),或者在加熱(rè)儀内65℃加熱(rè)6min後在加熱(rè)儀内自然冷(lěng)卻到30℃(适合于單鏈DNA模闆)。

1000rpm/min離心10s後在冰浴中冷(lěng)卻,并迅速進行下(xià)一步操作。

(3)标記反應在退火混合物(wù)中加入2l預冷(lěng)的(de)dNTP混合物(wù)(含dTTP、dGTP和(hé)dCTP各0.75mol/L,5C的(de)[a2P]dATP),1plo.1mol/LDDT,現稀釋的(de)測序酶2U,并用(yòng)水(shuǐ)将反應體系調整到15.5,混勻後在冰上孵育2min,放射性标記新合成的(de)DNA鏈。

(4)鏈延伸終止反應将3.5标記混合物(wù)分(fēn)别加入4管鏈延伸終止反應混合物(wù)中,37℃進行鏈延伸終止反應5min。

(5)終止反應體系在各管中加入4終止液(95%甲酰胺,20mmo/ L EDTA,0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯腈藍FF),終止反應。樣品可(kě)以一70℃保存2~7d。電泳前在電熱(rè)儀上80℃加熱(rè)3min。

(6)電泳分(fēn)離和(hé)放射自顯影(yǐng)每一泳道上樣2~3μl,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分(fēn)離。

P标記的(de)需要過夜曝光(guāng)顯影(yǐng),若用(yòng)P标記的(de)需要2~3d曝光(guāng)顯影(yǐng),讀片。

四、注意事項

①标記反應最爲關鍵,應在低進行性反應條件下(xià)進行。退火後引物(wù)隻被延伸20~80個(gè)核苷酸,并在新合成的(de)DNA鏈中摻入多(duō)個(gè)放射性标記。對(duì)高(gāo)GC堿基含量的(de)DNA模闆,可(kě)用(yòng)[aP]dCTP代替[aP]dATP。

②對(duì)高(gāo)GC堿基含量的(de)DNA模闆,鏈延伸終止反應混合物(wù)中應用(yòng)7-脫氧2dGTP替代dGTP,以消除電泳過程由于壓縮現象産生的(de)假帶。

循環測序法

一、原理(lǐ)

循環測序法是利用(yòng)熱(rè)循環儀高(gāo)效的(de)自動循環能力,使鏈終止的(de)序列産物(wù)以線性方式獲得(de)擴增,從而産生高(gāo)顯影(yǐng)度的(de)序列梯度。首先将PCR擴增的(de)DNA經變性形成單鏈形式,使标記引物(wù)(P、生物(wù)素或熒光(guāng)标記)與其中的(de)一條鏈上的(de)互補序列退火。退火後的(de)引物(wù)在耐熱(rè)DNA聚合酶催化(huà)下(xià)發生鏈延伸終止反應。由此産生的(de)模闆鏈與延伸終止鏈形成的(de)部分(fēn)雙鏈産物(wù)在下(xià)一輪測序循環中,再次被變性,釋放出模闆鏈,作爲又一輪引發反應的(de)模闆,同時(shí)積累下(xià)每輪循環産生的(de)鏈終止産物(wù)。這(zhè)種循環步驟重複20~40次,使鏈終止産物(wù)以線性方式擴增。

與直接測序法相比較,循環測序法有如下(xià)優點:所需的(de)模闆DNA量少;在高(gāo)溫下(xià)進行,可(kě)使DNA聚合酶催化(huà)的(de)聚合反應能夠通(tōng)過模闆二級結構的(de)區(qū)域;多(duō)輪的(de)變性步驟便于對(duì)質粒DNA、ADNA、黏粒DNA和(hé)PCR産物(wù)等雙鏈DNA模闆進行測定,不需要經過一個(gè)單獨的(de)變性步驟而直接進行測序。

二、材料

(1)模闆可(kě)用(yòng)PCR擴增好的(de)DNA作模闆,也(yě)可(kě)使用(yòng)低濃度的(de)dNTP(10~20mol/L)和(hé)引物(wù)(1mmol/L)來(lái)進行靶DNA的(de)PCR擴增,然後直接用(yòng)PCR産物(wù)作爲模闆。DNA模闆濃度:0.01mmol/L

質粒DNA模闆用(yòng)質粒純化(huà)試劑盒提取。對(duì)于高(gāo)拷貝數的(de)質粒可(kě)以直接從菌落中獲得(de)測序。測序反應的(de)質粒典型用(yòng)量:50~200mol

其它模闆(M13、黏粒及ADNA)的(de)制備爲常規分(fēn)子生物(wù)學手段。M3和(hé)ADNA作爲模闆用(yòng)量:10~100mo黏粒DNA作爲模闆用(yòng)量:50~200mol。